細胞RNAi技術(shù)
▏ RNAi技術(shù)服務(wù)
近年來(lái)的研究表明，將與mRNA同源的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA（dsRNA）導入細胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，從而抑制其相應基因的表達。這種轉錄后基因沉默機制（Post-transcriptional gene silencing, PTGS）被稱(chēng)為RNA干擾（RNAi）。由于RNAi具有高度的序列專(zhuān)一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此RNAi可以作為一種強有力的研究工具，用于功能基因組的研究。
科佰生物應用國外知名公司的RNAi Designer平臺，可對靶基因序列進(jìn)行干擾位置效應評價(jià)和序列同源型分析，完成siRNA/miRNA多種序列的的設計，并提供從siRNA合成、RNAi載體構建到RNAi功能驗證等全面的RNAi解決方案。
▏ siRNA合成服務(wù)
對于瞬時(shí)基因沉默實(shí)驗，化學(xué)合成siRNA的方法操作簡(jiǎn)便，容易獲得高水平的瞬時(shí)沉默效果，特異性強。我們通過(guò)嚴格設計來(lái)增強siRNA的專(zhuān)一性；針對某靶基因設計的3條siRNA可保證其中兩條的Knockdown效率達到75％（在轉染效率大于80％的情況下）。
在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個(gè)核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。激活的RISC通過(guò)堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA 3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。
▏ siRNA合成實(shí)驗流程
1）根據序列信息，進(jìn)行化學(xué)合成；
2）純化及定量；
3）凍干處理；
4）細胞轉染預實(shí)驗，優(yōu)化轉染條件；
5）瞬時(shí)轉染或穩定轉染；
6）RT-PCR或Western blot檢測轉染后某一時(shí)間點(diǎn)靶基因的RNA水平或蛋白水平的變化。
▏ 質(zhì)量保證
針對某靶基因設計的3條siRNA可保證其中2條的Knockdown效率達到75％（在轉染效率大于80％的情況下）。
▏ shRNA構建服務(wù)
構建shRNA表達載體，實(shí)現shRNA在細胞中穩定表達，能夠彌補瞬時(shí)轉染持續時(shí)間短的不足。
▏ shRNA構建實(shí)驗流程
1）mRNA序列分析；
2）引物設計及合成；
3）單鏈互補引物退火；
4）將片段克隆至載體；
5）測序以確保插入序列正確性；
6）細胞轉染預實(shí)驗，優(yōu)化轉染條件；
7）瞬時(shí)轉染或穩定轉染；
8）RT-PCR或Western blot檢測轉染后某一時(shí)間點(diǎn)靶基因的RNA水平或蛋白水平的變化。
▏ 質(zhì)量保證
針對某靶基因設計的3條shRNA序列，在轉染效率>80％的前提下，我們保證至少有1個(gè)克隆可以達到70％轉錄水平的沉默效率。
▏ miRNA構建服務(wù)
RNAi載體利用細胞內源性的miRNA加工機制，相比傳統shRNA載體可更高效地表達RNA發(fā)夾結構，并具有采用GFP進(jìn)行表達追蹤的優(yōu)點(diǎn)。每個(gè)基因設計的4條序列我們保證至少有2條可以達到至少70％轉錄水平的Knockdown效率（在轉染效率大于80％的情況下）。
▏ miRNA構建實(shí)驗流程
1）針對特定基因，設計miR RNAi序列，合成該序列并退火生成雙鏈DNA；
2）將DNA與載體連接并轉化；
3）測序驗證miRNA序列的正確性；
4）細胞轉染預實(shí)驗，優(yōu)化轉染條件；
5）瞬時(shí)轉染或穩定轉染；
6）RT-PCR或Western blot檢測轉染后某一時(shí)間點(diǎn)靶基因的RNA水平或蛋白水平的變化。
▏ 質(zhì)量保證
針對某靶基因設計的3條miRNA序列，在轉染效率>80％的前提下，我們保證至少有1個(gè)克隆可以達到70％轉錄水平的沉默效率。
▏ 客戶(hù)提供
1）目的基因的Accession Number（Human、Mouse或Rat種屬）以及技術(shù)要求（包括OD和nmols的精確數量、純化類(lèi)型和修飾要求等）；
2）細胞株和詳細的細胞培養的操作步驟；
3）一抗（如果需要Western blot檢測）。
▏ 服務(wù)說(shuō)明
1. RNAi技術(shù)服務(wù)不包括基因功能檢測，如需檢測，需要另外評估和收費；
2. 客戶(hù)可以提供實(shí)驗原材料，也可以查找本公司模板庫、載體庫、細胞庫，也可以由我們公司代購；
