▏ 什么是ADC藥物

ADC（Antibody-drug conjugate，ADC）藥物全稱(chēng)為抗體偶聯(lián)藥物，是將抗體通過(guò)偶聯(lián)臂（Linker）與小分子藥物（Payload）共價(jià)連接的復合物?？贵w負責靶向病灶，毒素通過(guò)自身特性殺傷目標細胞，連接子則是承擔橋接毒素和抗體直至ADC到達腫瘤細胞內再進(jìn)行釋放的功能。一個(gè)理想的ADC分子應該具備高靶點(diǎn)特異性、高腫瘤殺傷能力、長(cháng)藥代特性、低免疫原性、低脫靶毒性。
 

圖1. ADC藥物的結構圖示
 

 

▏ ADC藥物的作用機制

ADC藥物通過(guò)靜脈注射到血液中，隨著(zhù)血液的流動(dòng)，到達全身，但是科學(xué)家估計只有0.1%的ADC能到達患者的癌細胞。大部分會(huì )在循環(huán)系統和其他器官及組織中逐漸分解。到達癌細胞的ADC藥物一般是經(jīng)歷6個(gè)過(guò)程來(lái)起作用。

1. ADC藥物進(jìn)入血液循環(huán)；

2. ADC藥物與癌細胞表面抗原結合；

3. ADC藥物通過(guò)受體介導的內吞進(jìn)入腫瘤細胞；

4. 溶酶體通過(guò)組織蛋白酶和纖溶酶降解ADC藥物；

5. 在癌細胞中釋放Payload，藥物結合到靶點(diǎn)蛋白；

6. 毒性分子誘導細胞凋亡，細胞破裂，同時(shí)部分ADC藥物也可能殺死周?chē)陌┘毎?/span>

圖2. ADC藥物的作用機制模型

 

▏ ADC藥物活性評價(jià)平臺

1. ADC藥物與抗原結合能力檢測

1.1 bio-chemical assay

首先在生化水平(bio-chemical assay)上，可以采用ELISA的方式檢測ADC藥物與抗原的結合能力，常見(jiàn)的有Total Antibody ELISA、Conjugated Antibody ELIA、Conjugated drug ELISA。同樣的，針對PPI（Protein-Protein Interaction），biacore是一個(gè)強大的工具，可以得到更全面的動(dòng)力學(xué)結合分析數據。

圖3. ELISA方法檢測ADC藥物和抗原靶點(diǎn)的結合
 

1.2 Cell-based assay

一般生化水平檢測完，就需要做細胞水平(Cell-based assay)的結合能力檢測,可以選擇靶點(diǎn)陽(yáng)性的細胞來(lái)進(jìn)行，一般可以同時(shí)選擇不表達、低表達、中表達、高表達的細胞一起做，檢測方法一般采用流式細胞術(shù)（FACS）來(lái)檢測。

 

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圖4. 科佰生物現貨腫瘤細胞庫組織分類(lèi)示意圖

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同時(shí)科佰構建了300多株過(guò)表達ADC靶點(diǎn)的工程細胞株，全部是現貨供應，可以用于多種cell-based assay，比如ELISA、FACS、凋亡、增殖抑制等。
 

表1. 科佰生物部分現貨ADC靶點(diǎn)過(guò)表達工程細胞株列表

更多現貨ADC細胞模型，請點(diǎn)擊訪(fǎng)問(wèn)

 

2. ADC藥物的ADCC/ADCP/CDC效應

ADC藥物中針對腫瘤相關(guān)抗原的抗體，同樣也會(huì )存在A(yíng)DCC和ADCP效應。簡(jiǎn)而言之，抗體的Fab端與腫瘤細胞結合，抗體的Fc端，會(huì )與效應細胞的FcγR結合，通過(guò)抗體連接腫瘤細胞和效應細胞，則效應細胞就可以釋放因子來(lái)殺死或者吞噬腫瘤細胞。

 

 

圖5. ADCC/ADCP/CDC原理示意圖

 

科佰生物開(kāi)發(fā)了多種ADCC/ADCP的模型，采取的是報告基因的檢測方法，Luc的報告基因屬于化學(xué)發(fā)光，是一種不需要激發(fā)光、本底噪音信號較低的方法學(xué)，靈敏度高，適用于A(yíng)DC藥物的檢測。
 

貨號	模型名稱(chēng)	應用
CBP74002	ADCC Bioassay Effector Cell F variant (Low Affinity)- Fcγ-NFAT/Jurkat	Functional(Report Gene) Assay
CBP74003	ADCC Bioassay Effector Cell V variant (High Affinity)-Fcγ-NFAT/Jurkat	Functional(Report Gene) Assay
CBP74076	Mouse ADCC Bioassay Effector Cell	Functional(Report Gene) Assay

 

表2. 科佰生物現貨ADCC現貨工程細胞株

 

貨號	模型名稱(chēng)	應用
CBP74105	ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIa -NFAT/Jurkat	Functional(Report Gene) Assay
CBP74106	ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIIa (H variant) -NFAT/Jurkat	Functional(Report Gene) Assay
CBP74004	ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIIa (R variant) -NFAT/Jurkat	Functional(Report Gene) Assay

 

表3. 科佰生物現貨ADCP現貨工程細胞株

 

3. ADC藥物的內吞

ADC藥物與腫瘤細胞表面的抗原結合后，會(huì )觸發(fā)受體介導的內吞作用，ADC藥物被內吞進(jìn)入溶酶體中，溶酶體提供連接抗體和藥物的連接體裂解所需的酸性環(huán)境和酶，從而釋放細胞毒性有效載荷。常見(jiàn)的內吞機制分為“ 網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用”和“不依賴(lài)網(wǎng)格蛋白的內吞作用”。

 

ADC藥物的內吞作用是藥物起效的前提，內吞動(dòng)力學(xué)的研究能很好的幫助分析藥物的內吞過(guò)程、內吞效率、監測有效載荷的釋放。經(jīng)典的內吞動(dòng)力學(xué)研究，多用酸性PH敏感的熒光染料來(lái)標記ADC抗體。一般而言，胞外的PH為7.4左右，細胞質(zhì)的PH為7.0-7.2左右，而進(jìn)入溶酶體后，PH值會(huì )有明顯的下降，可以達到PH 4.7左右。在中性的環(huán)境下，沒(méi)有熒光，進(jìn)入溶酶體，變成酸性環(huán)境后，PH敏感的熒光染料，就會(huì )發(fā)出熒光信號。
 

 

圖6. Incucyte系統，可以長(cháng)期觀(guān)察多個(gè)時(shí)間點(diǎn)和濃度的細胞培養物
 

4. 載荷的毒性作用評價(jià)

ADC藥物從溶酶體中釋放有效載荷，這些載荷按照預期是可以殺死腫瘤細胞，常見(jiàn)的有效載荷分為幾類(lèi)：
 

表4. 常見(jiàn)Payload的類(lèi)型

 

4.1微管抑制劑(Microtubule Inhibitors):

這類(lèi)載荷通過(guò)干擾細胞微管的正常功能，抑制細胞分裂和增殖。常見(jiàn)的微管抑制劑包括：

MMAE/MMAF:一類(lèi)auristatin類(lèi)化合物，通過(guò)抑制微管蛋白聚合發(fā)揮細胞毒性。

DM1/DM4:一類(lèi)maytansinoid類(lèi)化合物，同樣作用于微管蛋白。

 

4.2DNA損傷劑(DNA-damaging agents):

這類(lèi)載荷通過(guò)損傷DNA，導致細胞死亡。常見(jiàn)的DNA損傷劑包括：

卡奇霉素(Calicheamicin):一種內酯類(lèi)抗生素，通過(guò)與DNA結合并產(chǎn)生自由基，導致DNA雙鏈斷裂。

吡咯并苯并二氮雜卓類(lèi)(PBDs):通過(guò)與DNA小溝結合，導致DNA交聯(lián)，阻止DNA復制和轉錄。?

 

4.3 拓撲異構酶抑制劑(Topoisomerase Inhibitors):

這類(lèi)載荷通過(guò)抑制拓撲異構酶的活性，影響DNA的復制和轉錄。常見(jiàn)的拓撲異構酶抑制劑包括：

SN38/DXd:一類(lèi)喜樹(shù)堿衍生物，是拓撲異構酶I的抑制劑。

 

4.4 其他類(lèi)型的載荷:

除了上述主要類(lèi)別，還有一些其他類(lèi)型的載荷正在開(kāi)發(fā)中，例如：RNA聚合酶II抑制劑:通過(guò)抑制RNA聚合酶II的活性，影響RNA轉錄。其他新型細胞毒性藥物:例如杜卡霉素、PNU-159682、鵝膏蕈堿等。
 

不同的載荷有不同的作用機制和毒性特征，因此常見(jiàn)的評價(jià)有效載荷的毒性作用，我們可以采取細胞增殖抑制檢測、細胞凋亡檢測、細胞周期檢測等手段。
 

細胞增殖抑制檢測一般采用CTG、CCK8檢測藥物對腫瘤細胞增殖的抑制效果。以CTG為例，主要是檢測活細胞中的ATP，以熒光素酶的催化發(fā)光作為最終的讀數，是一種化學(xué)自發(fā)光的檢測，靈敏度高。

圖7. CTG法檢測ADC藥物的腫瘤細胞抑制

 

細胞凋亡檢測有很多方法，常見(jiàn)的有FACS檢測Annexin V/PI double staining、檢測Caspase、DNA碎片分析、TUNEL等，這些方法可以稱(chēng)為是半定量，一般不適用于四參數擬合，計算藥效的EC50。
 

 

圖8. 通過(guò)檢測凋亡評定ADC藥物的毒性

有些ADC藥物的有效載荷是針對DNA復制相關(guān)的毒素，就會(huì )導致細胞周期的阻滯效果，比如Dxd毒素會(huì )導致細胞停滯在G2/M期。

 

 

圖9. 細胞周期分析ADC藥物有效載荷的作用
 

5. ADC藥物的旁觀(guān)者效應

旁觀(guān)者效應（Bystander efficacy）是指部分ADC藥物的有效載荷在釋放后可以滲透穿過(guò)細胞膜，進(jìn)入到腫瘤微環(huán)境中，或者陽(yáng)性細胞凋亡破裂后釋放有效載荷，滲透進(jìn)入靶點(diǎn)陰性的腫瘤細胞并進(jìn)行殺傷。

 

旁觀(guān)者效應在A(yíng)DC藥物的殺傷作用中非常重要，一般用于評價(jià)旁觀(guān)者效應的體外藥效的方法有兩種：（1）共培養體系，（2）介質(zhì)轉移法。細胞共培養（co-culture)是將兩種細胞（抗原陽(yáng)性Ag+、抗原陰性Ag-）混合共同培養，比較Ag-在共培養系統和單一培養系統中的活力，可以通過(guò)檢測腫瘤細胞的增殖抑制來(lái)比較。介質(zhì)轉移法是先用一定量的ADC處理Ag+細胞，一段時(shí)間后，將該介質(zhì)轉移到Ag-細胞。如果來(lái)自Ag+細胞的介質(zhì)對于A(yíng)g-比直接用同樣濃度的ADC處理體現出更好的殺傷效果，那么就可以說(shuō)明具有旁觀(guān)者效應。

 

以下以共培養體系為例，介紹體外方法學(xué)的開(kāi)發(fā)。

 

5.1 單一培養體系

因為ADC藥物的作用機制顯示，一來(lái)需要ADC藥物的抗原結合、內吞、酶切，二來(lái)部分有效載荷是跟細胞周期有關(guān)，需要細胞積累阻滯，因此一般做旁觀(guān)者效應之前需要先摸索藥物的作用時(shí)間（一般建議至少2個(gè)倍增周期）和有效濃度，來(lái)確保對陽(yáng)性細胞Ag+細胞的殺傷。
 

表5. 單一培養體系96孔板Layout設計
 

通過(guò)四參數擬合得到Ag+和Ag-細胞的殺傷曲線(xiàn)，計算出Ag+細胞的IC90，計算出Ag-細胞的IC50，注意這里建議藥物的濃度建議使用有效載荷濃度（非ADC藥物濃度）來(lái)做數據擬合。在下一步的細胞共培養體系中，可以選擇大于A(yíng)g+細胞IC90、同時(shí)小于A(yíng)g-細胞的IC50的濃度，來(lái)測試旁觀(guān)者效應。

 

5.2 共培養體系

在做共培養之前，我們需要明確幾點(diǎn)：

① 最好Ag-細胞帶Luc的標記，這樣屆時(shí)檢測時(shí)，只要針對Luc做信號檢測即可；

② 因為Ag-的殺傷來(lái)自于A(yíng)g+細胞的殺傷釋放，因此需要摸索不同的Ag+和Ag-共培養的細胞比例關(guān)系；

③ 旁觀(guān)者效應需要的時(shí)間更長(cháng)，如果細胞培養中，涉及添液（不可換液）的操作，則會(huì )稀釋毒素的濃度，進(jìn)而影響對Ag-細胞的殺傷；

④ 實(shí)驗中有各種因素會(huì )影響到這種長(cháng)周期的細胞增殖抑制實(shí)驗，因此我們一般是通過(guò)與Ag-單一細胞模型比較來(lái)判斷是否存在旁觀(guān)者效應。

常見(jiàn)的設計如下：
 

表6. 共培養體系96孔板Layout設計
 

6. 體內藥效評價(jià)

體內評價(jià)ADC藥物的活性，可以將細胞接種到小鼠上，做CDX模型。通過(guò)小鼠的皮下瘤、原位瘤的變化來(lái)檢測ADC藥物的藥效。同時(shí)如果做旁觀(guān)者效應的話(huà)，可以在A(yíng)g-的細胞上做Luc的標記，用活體動(dòng)物成像來(lái)檢測瘤的變化。

 

科佰生物提供3類(lèi)細胞產(chǎn)品助力體內的藥效評價(jià)，除了1.2中提供的1500多株腫瘤細胞、300多株過(guò)表達的工程細胞外，還提供160多種Luc標記的示蹤細胞，在接種皮下瘤時(shí)，可以通過(guò)活體成像來(lái)檢測瘤子的變化。
 

表7. 科佰生物部分現貨示蹤Luc細胞的清單展示

更多示蹤細胞，請點(diǎn)擊訪(fǎng)問(wèn)

 

▏ 總結

中國藥企在A(yíng)DC等領(lǐng)域經(jīng)過(guò)多年技術(shù)沉淀后，已具備開(kāi)發(fā)first in class（FIC）突破性療法的實(shí)力，并且能夠在新興賽道上擔當全球先鋒?；仡欉^(guò)去，國內獲批的ADC藥物更多是fast-follow策略下的成功實(shí)踐，這類(lèi)藥物也在海外市場(chǎng)獲得了一定認可，吃到了一波出海紅利，落地了大量BD交易，為國內創(chuàng )新藥出海積累了寶貴經(jīng)驗。
 

表8. 本文思路總結