▏ 服務(wù)原理

研究PCR技術(shù)從1983年開(kāi)始依次經(jīng)歷普通PCR，Real-Time PCR和dPCR，現如今dPCR技術(shù)的發(fā)展就像1990年代末的Real-Time PCR發(fā)展一樣，發(fā)展迅猛。
下面我們以DdPCR為例，討論dPCR技術(shù)。

什么是DdPCR? 有什么技術(shù)特征？有哪些方面的應用？
DdPCR全稱(chēng)Droplet Digital PCR，引用bio-rad的描述為Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.



從基本原理我們不難看出，DdPCR最大的優(yōu)點(diǎn)是絕對定量，表現為：

· 絕對定量 -ddPCR技術(shù)無(wú)需輸入標準曲線(xiàn)即可提供每個(gè)輸入樣品的目標DNA拷貝的絕對計數,使該技術(shù)非常適合目標DNA的測量，病毒載量分析和微生物定量；
· 較高的精確度 – ddPCR提供的大量樣品分配功能可以可靠地測量樣品中靶DNA序列拷貝數的微小差異；
· 提高信噪比 -稀釋高拷貝模板和背景，有效富集靶標陽(yáng)性分區中的模板濃度，從而可以靈敏地檢測稀有靶標，并實(shí)現±10％的定量精度，靈敏度可達單個(gè)核酸分子，檢測限低至0.001%；
· 消除PCR偏差 -消除qPCR的擴增效率依賴(lài)性，降低了錯誤率，可檢測到小的（1.2倍）差異，這里需要指出的是；
· 降低了耗材成本 -反應體積在皮升至納升的范圍內，減少了試劑的使用和每個(gè)數據點(diǎn)所需的樣品量，對于珍貴的樣品尤其適用；
· 降低設備成本 -基于乳液的反應系統意味著(zhù)PCR反應可以在標準的熱循環(huán)儀中進(jìn)行，而無(wú)需復雜的芯片或微流體。
· 出色的分區 -ddPCR技術(shù)每20 µl樣品可產(chǎn)生20,000個(gè)液滴，在96孔板上可進(jìn)行近200萬(wàn)個(gè)分區PCR反應，分區數量越多，精度越高。

▏ 服務(wù)應用

DdPCR技術(shù)有很多方面的應用，我們按照發(fā)表文章的領(lǐng)域，可以簡(jiǎn)單劃分為：



結合腫瘤領(lǐng)域，我們一般與之相關(guān)的有4個(gè)領(lǐng)域的應用：
1. 檢測Gene Expression，主要是檢測mRNA的定量分析；
2. 檢測Mutation（SNV和Indel），可以檢測拷貝數，也可以檢測比率；
3. 檢測CNV（拷貝數變異分析），相對定量；
4. 檢測Fusion，可以檢測拷貝數，也可以檢測比率；

▏ 案例展示

 同樣的，科佰生物也針對這4個(gè)應用開(kāi)發(fā)對應的檢測試劑盒，配套科佰生物的參考品，對試劑盒做性能評價(jià)，如下我們以EGFR T790M為例：
實(shí)驗一：靈敏度測試

待測樣本：不同%AF的EGFR T790M的標準品，依次為5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1%。

首先我們選擇50%的EGFR T790M標準品(CBP10402)，該標準品是通過(guò)基因編輯，二等位基因，CN=2，編輯一條為mutation，一條為WT，經(jīng)過(guò)理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗證，確認為50%的頻率。然后使用對應的host cell的gDNA，按照質(zhì)量比（Qubit 3.0 三次定量取平均）有限稀釋到5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1%，每個(gè)樣本準備3個(gè)重復，合計18個(gè)樣本同一次實(shí)驗檢測對應的頻率。

對應的數據為：


由以上數據可見(jiàn)，EGFR T790M檢測體系，對于0.1%都是能檢出，且符合標準，但是波動(dòng)比較大。另外實(shí)驗過(guò)程中，我們發(fā)現雖然DdPCR理論上可以生成20000個(gè)液滴，但是多次實(shí)驗表明，實(shí)際生成往往是低于這個(gè)數值，平均約為8000-10000個(gè)，液滴數越少，因此低于0.1%的頻率可能會(huì )波動(dòng)很大，影響真實(shí)值判斷。

實(shí)驗二：重復性測試

待測樣本：取1%和0.1%的EGFR T790M的標準品，分成8份，每份上樣10ng，一次實(shí)驗完成對應的定標。

對應的數據為：



由以上數據可見(jiàn)，EGFR T790M檢測體系是穩定可重復的，全部能檢出。

同樣的我們也對Gene Expression(mRNA)、CNV和Fusion開(kāi)發(fā)了部分DdPCR試劑盒，利用科佰特有的標準品產(chǎn)品，我們做了性能評價(jià)，陸續上線(xiàn)了多款產(chǎn)品，如下是我們已經(jīng)上線(xiàn)的DdPCR探針、引物的清單，全部在QX200上驗證過(guò)：

更多的DdPCR產(chǎn)品可以選擇科佰生物開(kāi)發(fā)定制，我們不僅可以開(kāi)發(fā)定制探針、引物，我們還有標準品用于驗證體系性能評價(jià)。