Flp-FRT定點(diǎn)整合穩定細胞株
▏ 名詞定義
Flp: Flp(flippase recombination enzyme)重組酶，是從酵母細胞內被發(fā)現的，其基因全長(cháng)1272bp，為48kDa大小的、由423個(gè)氨基酸組成的多肽單體蛋白。
FRT: FRT(Flp Recombination Target)是Flp的識別位點(diǎn)，全長(cháng)48bp，由3個(gè)13bp的反向回文序列和8bp的間隔序列共同組成。與間隔序列相鄰的兩個(gè)反向回文序列是Flp重組酶的識別和結合區域，間隔序列是重組發(fā)生的區域，也決定了整個(gè)序列的方向。
▏ Flp-FRT定點(diǎn)整合系統
Flp-FRT整合系統是一種用于構建穩定細胞系的方法，該細胞系可在宿主細胞基因組的特定位置表達目的基因。該系統利用 Flp 重組酶和 FRT（Flp 重組靶位）位點(diǎn)實(shí)現位點(diǎn)特異性重組和整合。該系統可實(shí)現目的基因的穩定表達，確保細胞中蛋白質(zhì)的持續生產(chǎn)。
▏ 工作原理
1. Flp-FRT細胞的構建： 將 Flp 重組靶位 (FRT) 位點(diǎn)引入宿主細胞系的基因組中，一般結構是ATG+FRT+抗性基因，根據母細胞選擇轉染方案，利用抗性篩選，可以得到穩定細胞株。 科佰思考1：一般認為這一步的構建，FRT會(huì )整合到細胞的轉錄活躍區位置，也就是說(shuō)為了后續的重組外源目的基因的表達，這一步的整合給了外源蛋白過(guò)表達提供了一定的保障。 科佰思考2：作為常規的質(zhì)粒轉染方案，宿主細胞能整合幾個(gè)拷貝進(jìn)去？選擇幾個(gè)拷貝為好？一般而言構建Flp-FRT母細胞時(shí)，轉染后是隨機整合，也就是會(huì )存在多個(gè)拷貝整合到宿主細胞的不同染色體位置。整合的越多，未來(lái)目的基因重組整合的也多，也就是表達會(huì )更高，但是反過(guò)來(lái)未來(lái)重組目的基因時(shí)，多個(gè)拷貝的整合效率可能不是100%的，也就是會(huì )出現混合克?。寺￠g表達高低不一致），有時(shí)針對不需要表達很高的目的蛋白，科佰建議選擇1個(gè)拷貝的整合克隆，這樣未來(lái)只要經(jīng)過(guò)抗性篩選的克隆，從原理上說(shuō)就是單克隆，省去了有限稀釋做單克隆的過(guò)程。 拷貝數檢測，可以咨詢(xún)我們的dPCR檢測服務(wù)。 科佰生物內部現貨Flp-FRT細胞 Cell line Host cell line Characteristic Flp-FRT CHO CHO-K1 Adherent Flp-FRT HEK293 HEK293 Adherent Flp-FRT HCT116 HCT116 Adherent Flp-FRT Jurkat Jurkat Suspension 2. 目的基因的整合： 將含有目的基因的表達載體、含有Flp重組酶的表達載體共轉入第一步中的細胞。在Flp 重組酶的介導下，宿主基因組中的 FRT 位點(diǎn)與表達載體中的 FRT 位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組，達到目的基因整合的目的，在啟動(dòng)子的作用下，穩定表達。 載體一: 過(guò)表達Flp重組酶，無(wú)需抗性，無(wú)需穩定整合 載體二: 含有目的基因，第二種抗性基因篩選標記 重組過(guò)程： 最終形成： 重組后，可以通過(guò)第二種抗性基因來(lái)選擇得到陽(yáng)性細胞，改細胞對抗性基因-2耐受，對抗性基因-1敏感 
具體的整合位置可以咨詢(xún)我們的ISS（integration site search）服務(wù)。
▏ Flp-FRT系統的優(yōu)勢
1 定點(diǎn)整合，不會(huì )隨機整合穿插到染色體的任意位置； 2 可控拷貝數，可以通過(guò)Flp-FRT細胞的拷貝數來(lái)控制目的基因的拷貝數； 3 穩定表達，相對于隨機整合，該表達系統更穩定，同時(shí)可以同抗性基因2篩選，用抗性基因1驗證； 4 表達量高，重組酶整合效率高，且整合在轉錄活躍區； 5 實(shí)驗周期短，選擇單拷貝的基因組，可以省去有限稀釋制備單克隆的過(guò)程。
▏ 穩定細胞株構建服務(wù)
科佰生物提供“Flp-FRT定點(diǎn)整合系統”穩定細胞株構建服務(wù)，利用該系統，我們已經(jīng)成功構建超過(guò)200株穩定細胞株的模型，有著(zhù)豐富的經(jīng)驗，歡迎溝通咨詢(xún)。 質(zhì)粒轉染 病毒感染 Flp-FRT系統 轉座子系統 基因編輯 脂質(zhì)體 電轉 慢病毒 適用細胞 部分細胞 幾乎所有細胞 幾乎所有細胞 內部4種細胞 幾乎所有細胞 部分細胞 轉染/感染效率 低 中 高 高 高 低 隨機整合 是 是 是 否 - 否 生物安全等級 BL1 BL1 BL2 BL1 BL1 BL1 基因裝載能力 - - <4-5k - - - 陽(yáng)性率 低 高 高 高 高 低 周期 基因合成 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 病毒包裝 - - 1周 - 混合克隆篩選 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 單克隆篩選 >3 周 >3 周 >3 周 可選 可選 >3 周 合計 > 8-10 周 > 8-10 周 >9-11周 5-7 周 5-7 周 > 8-10 周 工作負荷 高 中 中 低 低 高
